Diagnostico da infecção pelo HIV-1 em crianças nascidas de mães HIV positivas, atraves da "nested pcr" (reação em cadeia da polimerase)

O diagnóstico da infecção pelo HIV é usualmente estabelecido por ensaios sorológicos, que identificam anticorpos específicos contra o HIV. Entretanto, o recém-nato pode receber os anticorpos matemos da classe IgG, durante a gestação, no momento do parto, ou após o nascimento e com isso apresentar resultados falsos positivos até cerca de 18 meses de vida. Há vários outros métodos para o diagnóstico do HIV -1 em crianças, mas o que está sendo indicado atualmente é a reação em cadeia da polimerase (PCR) , por ser um método rápido, de alta sensibilidade e especificidade, que podem ser potencializadas com a realização de uma segunda reação de amplificação (''Nested-PCR''). A PCR detecta fragmentos-alvo do genoma viral. Com base na necessidade de um diagnóstico precoce do HIV-1, o presente trabalho teve como objetivo a padronização da técnica da ''Nested-PCR'', com utilização de "primers" que flanqueiam 4 regiões virais conservadas do HIV -1 (genes gag, env - 2 regiões e pol), para detecção do HIV-I, e aplicação do método em 41 crianças (com no mínimo 2 e no máximo 4 coletas de amostragem de sangue periférico) em seguimento no Hospital de Clínicas da UNICAMP, com suspeita de infecção. Os dados permitiram um estudo comparativo entre o diagnóstico feito pela ''Nested-PCR'' com os resultados obtidos pelo método soro lógico imunoenzimático ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), apesar das crianças apresentarem idade inferior a 18 meses, não tendo portanto o ELISA como teste padrão-ouro. Com base nos resultados da ''Nested-PCR'' foi calculada uma proporção de crianças infectadas pelo HIV que estão em seguimento no ambulatório de Imunodeficiência Pediátrica e que foram incluídas neste trabalho. Foi analisada também, a influência do uso da zidovudina (AZT), do tipo de parto (cesárea ou normal) e do aleitamento materno, já que esses fatores são influentes para o aumento da transmissão perinatal do HIV -1. Os resultados positivos obtidos pela ''Nested-PCR'' para a l' coleta de sangue periférico das crianças em estudo foi de 26,32%; para a 1a coleta, manteve-se o mesmo valor, e para a 3a coleta, 26,67%. Os resultados positivos pelo ELISA, para as 1a, 2a e 3a coletas foram respectivamente 86,84%; 78,95% e 56,67%. A proporção de crianças infectadas pelo HIV na população estudada foi de 29,3%. A análise da relação do uso profilático do AZT no período gestacional apresentou um "p", (obtido pelo teste de Fisher), de 0,05 para as (1a e 2a coletas e 0,014 para a 3a coleta; esses resultados sugerem que houve significância entre o uso do AZT (por parte materna) e a redução da transmissão vertical do HIV-l. Em relação ao aleitamento materno, os valores de "p" foram: 0,006 (1a e 2a coletas) e 0,016 ( 3a coleta) sugerindo também, associação com a redução da transmissão vertical do HIV-1, nesta população. A análise das crianças as quais as mães fizeram uso dos fatores associados à redução da infecção pelo HIV via perinatal (uso do AZT durante a gestação; parto do tipo cesárea e não aleitamento materno) mostrou um percentual de 20% de positividade à infecção pelo HIV-1 pela "Nested-PCR"; já nas crianças nascidas de mães que não fizeram uso de tais fatores, esse percentual elevou-se para 75%. Os resultados obtidos pela "Nested-PCR" foram confirmados em algumas amostras, através da hibridação e do método de seqüenciamento direto de seqüências gênicas do HIV -1. Os resultados obtidos neste estudo sugeriram que a "Nested-PCR" foi um método rápido e precoce para o diagnóstico da infecção pelo HIV -1 via perinatal. A utilização dos fatores associados à redução da infecção pelo HIV via perinatal indicadas às gestantes infectadas sugeriram influência na redução da transmissão perinatal do vírus na população estudadaThe diagnosis of the HIV infection is usually set by serologic assays that identify specific antibodies against the HIY. However, the newborn can get the IgG c1ass maternal antibodies, during the pregnancy, at the delivery time, or after berth, and thus, can present false-positive results up to about 18 months old. There are several other methods to the diagnosis of the HIV -1 in children, but, nowadays, PCR (polymerase chain reaction) is the one that is being suggested because it is a quick method with high sensitivity and specificity that can be risen by performing a 2nd amplification reaction (Nested PCR). The PCR detects target fragments ofthe viral genome. Based on the necessity of an early diagnosis ofthe HIV-1, the present study had as goal the standardization of the Nested-PCR technique with the utilization of the primers that flank 4 preserved viral areas of the HIV -1 (gens gag, env - 2 areas and paI) to the detection of the HIV -1 and the application of the method in 41 infants (with at least 2 collects and at most 4 collects of the peripheral blood sample) followed at Hospital de Clínicas da UNICAMP, with suspicion of infection. The data allowed a comparative study between the diagnosis made by the ''Nested-PCR'' and the diagnosis obtained trom the serologic immune enzymatic method, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), in spite ofthe children had been under 18 months old, they did not have the ELISA as a gold-standard test. Based on the results of the Nested PCR, a rate of the HIV infected children who are being followed at the ambulatory de Immunodeficiency Pediatric and that were inc1uded in this work was evaluated. The influence of the use of Zidovudine (AZT), the type of the delivery (caesarian or normal), and the maternal breastfeeding were also analyzed since these factors are known to be influent to augment the HIV -1 perinatal transmission. The positive results acquired by the Nested-PCR to the 1st peripheral blood collect of the children under study were 26,32%; to the 2nd collect, the same value was maintained, and to the 3rd collect, 26,67%. The positive results by ELISA, to the 1st, 2nd, and 3rd collects, were 86,84%, 78,95%, and 56,67% respectively. The rate of the HIV infected children in the studied population was 29,3%. The analyzes of the association of the prophylactic use of AZT during the pregnancy period presented 0,05% 'p' (obtained by the Fisher's test) to the 1st and 2nd collects, and 0,014 to the 3rd collect. These results suggest that there was significance between the use of AZT (on the mother' s side) and a reduction of the HIV -1 vertical transmission. Regarding the maternal breastfeeding the values of 'p' were: 0,006 (1st and 2nd collects) and 0,016 (3rd collect), also suggesting association with the reduction of the HIV-1 vertical transmission in this population. The analysis from children whose mothers made use ofthe factors related to the reduction ofthe HIV infection via perinatal (use of AZT, during the pregnancy; cesarian delivery, and non maternal breastfeeding), showed a 20% percentage ofthe positiveness to the HIV-1 infection by Nested-PCR; yet in the children bom from mothers that did not made any use of such factors, this percentage increased to 75%. The results obtained by the "Nested-PCR" were confirmed in some of the samples, through the hybridization and the direct sequencing method of the HIV-1 genetics sequences. The results obtained in this study suggest that the Nested-PCR is really an early and quick method to the diagnosis to the HIV -1 infection via perinatal. The use of the factors related to the reduction of the perinatal HIV infection indicated to the infected pregnants suggested the influence in the reduction of the perinatal transmission of the virus in the studied populatio